氨基酸組分分析
如果目前分離蛋白質(zhì)組的技術是2-DE,那么隨之而來的挑戰(zhàn)是數(shù)百數(shù)千個蛋白如何被鑒定. 在這里,我們不考慮傳統(tǒng)的蛋白鑒定方法,如免疫印跡法、內(nèi)肽的化學測序、已知或未知蛋白的comigration分析,或者在一個有機體中有意義的基因的過表達. 并不是因為這些方法無效,而是因為它們通常耗時、耗力,不適合高流通量的篩選. 目前,所選用的技術包括對于蛋白鑒定的圖象分析、微量測序;進一步對肽片段進行鑒定的氨基酸組分分析.ELISA試劑盒
(1) 圖象分析技術(Image analysis).
“滿天星”式的2-DE圖譜分析不能依靠本能的直覺,每一個圖象上斑點的上調(diào)、下調(diào)及出現(xiàn)、消失,都可能在生理和病理狀態(tài)下產(chǎn)生,必須依靠計算機為基礎的數(shù)據(jù)處理,進行定量分析. 在一系列高質(zhì)量的2-DE凝膠產(chǎn)生(低背景染色,高度的重復性)的前提下,圖象分析包括斑點檢測、背景消減、斑點配比和數(shù)據(jù)庫構建. 首先,采集圖象通常所用的系統(tǒng)是電荷耦合CCD(charge coupled device)照相機;激光密度儀(laser densitometers)和Phospho或Fluoroimagers,對圖象進行數(shù)字化. 并成為以象素(pixels)為基礎的空間和網(wǎng)格. 其次,在圖象灰度水平上過濾和變形,進行圖象加工,以進行斑點檢測. 利用Laplacian,Gaussian,DOG(difference of Gaussians) opreator使有意義的區(qū)域與背景分離,限定斑點的強度、面積、周長和方向.
圖象分析檢測的斑點須與肉眼觀測的斑點一致. 在這一原則下,多數(shù)系統(tǒng)以控制斑點的重心或zui高峰來分析,邊緣檢測的軟件可描述斑點外觀,并進行邊緣檢測和鄰近分析,以增加度. 通過閾值分析、邊緣檢測、銷蝕和擴大斑點檢測的基本工具還可恢復共遷移的斑點邊界. 以PC機為基礎的軟件Phoretix-2D正挑戰(zhàn)古老的Unix為基礎的2-D分析軟件包. 第三,一旦2-DE圖象上的斑點被檢測,許多圖象需要分析比較、增加、消減或均值化. 由于在2-DE中出現(xiàn)100%的重復性是很困難的,由此凝膠間的蛋白質(zhì)的配比對于圖象分析系統(tǒng)是一個挑戰(zhàn). IPG技術的出現(xiàn)已使斑點配比變得容易.
因此,較大程度的相似性可通過斑點配比向量算法在長度和平行度觀測. 用來配比的軟件系統(tǒng)包括Quest,Lips,Hermes,Gemini等,計算機方法如相似性、聚類分析、等級分類和主要因素分析已被采用,而神經(jīng)網(wǎng)絡、子波變換和實用分析在未來可被采用. 配比通常由一個人操作,其手工設定大約50個突出的斑點作為“路標”,進行交叉配比. 之后,擴展至整個膠. 例如:的PI和MW(分子量)的估計通過參考圖上20個或更多的已知蛋白所組成的標準曲線來計算未知蛋白的PI和MW. 在凝膠圖象分析系統(tǒng)依據(jù)已知蛋白質(zhì)的pI值產(chǎn)生PI網(wǎng)絡,使得凝膠上其它蛋白的PI按此分配.
所估計的度大大依賴于所建網(wǎng)格的結構及標本的類型. 已知的未被修飾的大蛋白應該作為標志,變性的修飾的蛋白的PI估計約在±0.25個單位. 同理,已知蛋白的理論分子量可以從數(shù)據(jù)庫中計算,利用產(chǎn)生的表觀分子量的網(wǎng)格來估計蛋白的分子量. 未被修飾的小蛋白的錯誤率大約30%,而翻譯后蛋白的出入更大. 故需聯(lián)合其他的技術完成鑒定. ELISA試劑盒
(2) 微量測序(microsequencing).
蛋白質(zhì)的微量測序已成為蛋白質(zhì)分析和鑒定的基石,可以提供足夠的信息. 盡管氨基酸組分分析和肽質(zhì)指紋譜(PMF)可鑒定由2-DE分離的蛋白,但zui普通的N-末端Edman降解仍然是進行鑒定的主要技術. 目前已實現(xiàn)蛋白質(zhì)微量測序的自動化. 首先使經(jīng)凝膠分離的蛋白質(zhì)直接印跡在PVDF膜或玻璃纖維膜上,染色、切割,然后直接置于測序儀中,可用于subpicomole水平的蛋白質(zhì)的鑒定.
但有幾點需注意:Edman降解很緩慢,序列以每40 min 1個氨基酸的速率產(chǎn)生;與質(zhì)譜相比,Edman降解消耗大;試劑昂貴,每個氨基酸花費3~4$. 這都說明泛化的Edman降解蛋白質(zhì)不適合分析成百上千的蛋白質(zhì). 然而,如果在一個凝膠上僅有幾個有意義的蛋白質(zhì),或者如果其他技術無法測定而克隆其基因是必需的,則需要進行泛化的Edman降解測序.
近來,應用自動化的Edman降解可產(chǎn)生短的N-末端序列標簽,這是將質(zhì)譜的序列標簽概念用于Edman降解,業(yè)已成為一種強有力的蛋白質(zhì)鑒定. 當對Edman的硬件進行簡單改進,以迅速產(chǎn)生N-末端序列標簽達10~20個/d,序列檢簽將適于在較小的蛋白質(zhì)組中進行鑒定.若聯(lián)合其他的蛋白質(zhì)屬性,如氨基酸組分分析、肽質(zhì)質(zhì)量、表現(xiàn)蛋白質(zhì)分子量、等電點,可以更加可信地鑒定蛋白質(zhì). 選擇BLAST程序,可與數(shù)據(jù)庫相配比. 目前,采用一種Tagldent的檢索程序,還可以進行種間比較鑒定,又提高了其在蛋白質(zhì)組研究中的作用.ELISA試劑盒
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